托品烷生物碱（tropane alkaloids, TAs）是一类以托品烷环为特征的植物次生代谢产物。其中托品衍生的代表性化合物莨菪碱和东莨菪碱作为抗胆碱基本药物，用于麻醉镇痛、止咳平喘、舒缓胃肠不适、治疗晕动症、缓解近视和解除有机磷农药中毒等。近年来西南大学、西部（重庆）科学城种质创制大科学中心青蒿创制实验室廖志华教授团队在托品及其衍生物的生物合成途径解析和演化机制方面开展了大量工作。
从鸟氨酸和苯丙氨酸到东莨菪碱的完整生物合成途径，总共有13个基因，廖志华团队报道了其中5个基因：鸟氨酸脱羧酶ODC（Zhao et al. ACS Synthetic Biology. 2020）、苯丙酮酸还原酶PPAR（Qiu et al. Organic Letters. 2018）、苯乳酸葡萄糖基转移酶UGT1和海螺碱合酶LS（Qiu et al. New Phytologist. 2020）以及莨菪醛脱氢酶HDH（Qiu et al. ACS Catalysis. 2021），为东莨菪碱生物合成途径的完整解析做出了重要贡献并为采用代谢工程或合成生物技术生产莨菪碱和东莨菪碱提供了必需基因。廖志华教授团队建立了以除草剂为唯一筛选压力的TAs栽培药材颠茄高效遗传操作技术体系，利用自主发现的TAs基因培育出莨菪碱/东莨菪碱高产且抗除草剂的颠茄转基因纯系（Zhang et al. Metabolic Engineering. 2022；Zhang et al. Industrial Crops and Products. 2021）。此外，廖志华团队通过详尽的基因组研究，揭示了茄科植物中TAs生物合成的演化机制，并发现了可用于哮喘药物异丙托溴铵前体合成的莨菪碱N-脱甲基脱氢酶HNDM（Zhang et al. Nature Communications. 2024）。
但茄科植物中还广泛分布着另一类TAs，即假托品衍生物，如惕佫酰假托品（3β-tigloyloxytropane）和打碗花精（calystegines）。惕佫酰假托品，也叫惕佫列定（tigloidine）或托品林（tropigline），可用于帕金森症等神经退行性疾病的治疗；打碗花精具有强烈的糖苷酶抑制剂活性，具有治疗代谢综合症的潜力。目前对假托品衍生物生物合成的了解非常有限，利用代谢工程或合成生物技术高效生产这些有价值的假托品衍生物也因此受限。
2024年4月29日，廖志华教授团队在Nature Communications上发表了题为《Discovering a mitochondrion-localised BAHD acyltransferase involved in calystegine biosynthesis and engineering the production of 3β-tigloyloxytropane》的研究论文。通过代谢物与基因表达的关联分析，该研究发现一个根特异性表达的BAHD-AT候选基因，被命名为惕佫酰假托品合酶（3β-Tigloyloxytropane Synthase，TS）。重组蛋白的体外酶活和酶动力学分析表明，TS主要催化假托品和惕佫酰CoA合成惕佫酰假托品。
图注：托品醇衍生物的生物合成
在颠茄幼苗中通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）抑制TS的表达。TS-VIGS株系中惕佫酰假托品、乙酰假托品、惕佫酰降假托品、惕佫酰-1-羟基降假托品和打碗花精A3的含量显著降低，且假托品和托品的含量显著提高。联合体外酶活分析和植物体内实验可知，TS通过催化惕佫酰假托品的生成参与打碗花精的生物合成。
已有研究认为，BAHD-ATs定位在细胞质中。有趣的是，TS的N-端包含潜在的线粒体定位信号序列。在烟草原生质体中瞬时表达TS及其N端定位信号融合的荧光蛋白，激光共聚焦显微镜分析发现其与线粒体特异性染料完全重叠。颠茄侧根中分离得到的线粒体组分能催化假托品和惕佫酰CoA合成惕佫酰假托品。以上实验证明，TS定位于植物线粒体。
图注：TS定位于植物线粒体
通过AlphaFold2生成了TS的蛋白质结构模型，并采用分子对接构建了酶-底物的复合物模型。该模型显示，HXXXD基序中的His162与假托品的氧原子形成氢键（距离3.0 Å），该位点是BAHD-ATs中普遍保守的催化残基，是TS催化口袋中的碱催化剂；His162、Ile35、Gln39、Asn298、Leu300、Tyr280和Trp340共同构成了TS的假托品结合口袋。丙氨酸扫描突变证实上述位点是维持TS催化活性的关键氨基酸残基。
图注：TS的催化机制解析
酶动力学分析结果表明，TS主要利用短链酰基CoA硫酯作为酰基供体，而不是具有芳环的苯甲酰CoA。TS控制酰基供体严格识别的机制是一个有趣的科学问题。通过对TS与可卡因合酶EcCS（其酰基供体为苯甲酰CoA）底物口袋的比较和氨基酸定点突变发现，Phe46是决定TS对短链酰基CoA硫酯严格识别的关键氨基酸。F46I突变显著增强了TS合成苯甲酰假托品的活性，并显著降低了TS合成惕佫酰假托品的活性。通过对TS催化口袋氨基酸的序列一致性设计，该研究发现将TS第40位的氨基酸突变为苏氨酸可以显著提高其催化活性。
图注：Phe46是决定TS对短链酰基CoA硫酯严格识别的关键氨基酸
为进一步评估TS的功能及其在植物合成生物学中的应用，该研究在烟草叶片中从头构建了假托品酯化物的生物合成途径，将六个上游生物合成基因（EnODC、AbPMT、AbMPO、AbPYKS、AbCYP82M3和DsTRII）与TS一起在烟草叶中进行了瞬时共表达，随后在烟草叶中检测到了托品酮、古豆碱、假托品、惕佫酰假托品和乙酰假托品。对照组未检测到惕佫酰假托品及其前体。将野生型TS替换为TSS40T，烟草叶片中惕佫酰假托品和乙酰假托品的产量进一步提高，分别增加了1.33倍和5.02倍。
图注：在烟草中从头合成惕佫酰假托品
由于植物中假托品酯化物的产量较低，因此作者希望能建立一个工程化的大肠杆菌生物反应器，通过提供易得的底物来半合成惕佫酰假托品。在大肠杆菌中表达TS（或其突变体），并在培养基中添加假托品，可检测到乙酰假托品的生成，但未检测到惕佫酰假托品的生成。研究人员推测，这可能是由于大肠杆菌中惕佫酰CoA供应不足所致。利用CoA连接酶的底物杂泛性，研究人员发现绿针假单胞菌（Pseudomonas chlororaphis）来源的异丁酰CoA合成酶（PcICS），能催化CoA和惕佫酸合成惕佫酰CoA。在大肠杆菌中共表达TSS40T和PcICS基因，并向培养基中饲喂假托品和惕佫酸，惕佫酰假托品的产量最高可达357.40 mg.L-1，摩尔转化率可达90.9%。
图注：在大肠杆菌中高效半合成惕佫酰假托品
总的来说，该研究进一步完善了TAs生物合成途径，为假托品酯化物的代谢工程和合成生物学研究提供了必需的功能基因，丰富了对BAHD-AT亚细胞定位和催化机制的认识，并最终实现了神经退行性疾病治疗药物惕佫酰假托品的高效半合成。
西南大学生命科学学院2019级博士研究生、种质创制大科学中心青蒿团队曾俊岚为该论文第一作者，廖志华教授为通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金面上项目（32370277）、科技创新2030-重大项目（2023ZD04076）和中央本级重大增减支项目“名贵中药资源可持续利用能力建设”（2060302）的资助以及西部（重庆）科学城种质创制大科学中心的支持。
论文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-47968-0
第一作者介绍：
曾俊岚，四川宜宾人，西南大学生命科学学院2019级博士生。主要从事药用植物天然产物生物合成与合成生物学研究。以第一作者在Nature Communications、Industrial Crops and Products、Plant Cell Tissue and Organ Culture和发表研究论文3篇；以通讯作者在Journal of Agricultural and Food Chemistry发表研究论文1篇；以共同第一作者在ACS Catalysis和Biochemical and Biophysical Research Communications发表研究论文2篇；授权国家发明专利4项，其中第一发明人2项。曾获得中国国际“互联网+”大学生创新创业大赛高教主赛道全国总决赛金奖（排名第一）、重庆市青少年科技创新市长奖、川渝科技学术大会一等奖、“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛重庆赛区特等奖、感恩中国近现代科学家奖学金、浦洛通生命科学一等奖励基金、兴明创新创业奖、博士研究生国家奖学金、重庆市向上向善好青年、重庆市普通高校学生创新能力提升先进个人和西南大学优秀共产党员等奖项荣誉。担任Nature Chemical Biology和Heliyon期刊青年审稿人。
通讯作者介绍：
廖志华，四川宜宾人，西南大学生命科学学院二级教授，中国中西医结合学会分子生药学专业委员会副主任委员。西部（重庆）科学城种质创制大科学中心青蒿创制团队负责人。长期从事植物天然产物生物合成与代谢工程研究，特别聚焦于两个研究方向：1）托品烷生物碱生物合成与合成生物学研究；2）青蒿素生物合成代谢调控与代谢工程研究。在托品烷生物碱研究方面，发现了托品烷生物碱生物合成途径中 7个酶及其基因（ODC、PPAR、UGT1、LS、HDH、HDNM和TS），为托品烷生物碱生物合成途径的解析做出了重要贡献并为莨菪碱和东莨菪碱在酵母中的生物合成提供了必需的基因；阐明了茄科植物中 TAs 生物合成途径的演化过程；建立了以草甘膦为筛选压力的颠茄植株再生技术，培育出莨菪碱/东莨菪碱高产且抗除草剂草甘膦的颠茄转基因纯系。在青蒿研究方面，系统解析了ABA/干旱促进青蒿素及萜类积累的代谢调控机制，并培育出多个青蒿新品种，在重庆酉阳实现大面积推广，有力促进了药农增收和企业增效。作为通讯作者在Nature Communications、ACS Catalysis、Metabolic Engineering、Molecular Plant、Acta Pharmaceutica Sinica B、New Phytologist、Organic Letters和ACS Synthetic Biology等期刊发表研究论文60余篇，转让4项TAs研究的授权发明专利。
参考文献：
Zeng et al. Discovering a mitochondrion-localized BAHD acyltransferase involved in calystegines biosynthesis and engineering the production of 3β-tigloyloxytropane. Nature Communications. 2024. 15, 3623, 1-16. https://doi.org/10.1038/s41467-024-47968-0.
Zhang et al. Revealing evolution of tropane alkaloid biosynthesis by analyzing two genomes in the Solanaceae family. Nature Communications. 2023, 14, 1446, 1-18. https://doi.org/10.1038/s41467-023-37133-4.
Qiu et al. Biochemical and Metabolic Insights into Hyoscyamine Dehydrogenase. ACS Catalysis. 2021. 11, 2912–2924. https://dx.doi.org/10.1021/acscatal.0c04667.
Qiu et al. Functional genomics analysis reveals two novel genes required for littorine biosynthesis. New Phytologist. 2020. 225, 1906–1914. https://doi.org/10.1111/nph.16317.
Qiu et al. A Phenylpyruvic Acid Reductase Is Required for Biosynthesis of Tropane Alkaloids. Organic Letters. 2018. 20, 7807–7810. https://doi.org/10.1021/acs.orglett.8b03236.
Zhao et al. Engineering tropane alkaloid production based on metabolic characterization of ornithine decarboxylase in Atropa belladonna. ACS Synthetic Biology. 2020. 9, 437–448. https://doi.org/10.1021/acssynbio.9b00461.
Zhang et al. Engineering tropane alkaloid production and glyphosate resistance by overexpressing AbCaM1 and G2-EPSPS in Atropa belladonna. Metabolic Engineering. 2022. 72, 237–246. https://doi.org/10.1016/j.ymben.2022.03.014.
Zhang et al. Development of homozygous transgenic Atropa belladonna plants with glyphosate resistance and high-yield scopolamine using metabolic engineering. Industrial Crops and Products. 2021. 171, 113953. https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2021.113953.