当前位置: 首页 > 种业博览 > 正文
杨树创制团队张勇教授课题组开发识别“5-NNTA-3”回文PAM位点的CRISPR-FrCas9植物基因组编辑新系统
发布时间: 2024-06-11 11:28  作者:种创中心   来源:内部   浏览次数:

来自IICRISPR-Cas细菌适应性免疫系统的CRISPR-Cas9已被设计为包括植物在内的多种生物体的有效基因组编辑工具。然而广泛使用的SpCas9主要识别5-NGG-3 PAM的特性限制了可编辑范围,特别是在A/T富集的启动子等调控序列及非蛋白编码RNA序列的有效编辑。近日,Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了由西部(重庆)科学城种质创制大科学中心西南大学张勇课题组及其合作团队撰写的Expanding plant genome editing scope and profiles with CRISPR-FrCas9 systems targeting palindromic TA sites”论文。该研究针对来源于Faecalibaculum rodentium的可识别5-NNTA-3’ 回文PAM基序的CRISPR-FrCas9植物基因组编辑新系统,构建了高活性、高特异性且识别A/T富集PAM的植物基因组编辑新工具,扩大了植物基因组编辑范围,并在此基础上进行了有效的植物蛋白编码基因敲除编辑、启动子调控编辑、microRNA敲除编辑。全文主要研究结果如下:

1.FrCas9在植物基因组编辑中的特性分析

SpCas9相比,FrCas9的回文5-NNTA-3 PAM会增加sgRNA分布的密度(1 a-c),在水稻基因组编码及非编码区,FrCas9SpCas9可以设计更多的靶位点(1 d)。作者测试了不同的sgRNA scaffold对于FrCas9编辑活性的影响,截短了4bpsgRNA V02表现出最高的编辑活性(1 e-f)。进一步,作者探究了FrCas9系统在水稻内源基因位点的编辑效率,经原生质体转化、扩增子测序结果表明,FrCas9在所选择的16个位点中均表现出了较高的编辑活性(1 g)。同时,FrCas9在编辑点主要引起的插入多于删除(1 h),删除主要发生在FrCas9切割位点周围(1 i),主要产生1bp删除(1 j),插入主要发生在PAM周围(1 k),主要产生1bp插入(1 l)。

1 CRISPR-FrCas9在植物基因组编辑中的特性研究

2.FrCas9在水稻稳定植株中的高效编辑

进一步测试FrCas9系统在水稻稳定转化植株中的编辑能力,作者在水稻T0代植株中应用FrCas9实现了有效的基因编辑,在所有测试的位点都可以获得突变的T0代植物,突变效率为10%-85.7%;在测试的6个位点中,有5个位点有双等位基因突变,双等位突变编辑效率为35%-80.7%2 a-b)。对FrCas9OsGn1aOsGS3基因编码区域产生的编辑植株进行了进一步研究,OsGn1a双等位基因突变体都显示出每穗粒数和每穗一级分枝数增加(2 c-f);OsGS3双等位基因突变体都显示出种子长度增加,但种子宽度或种子厚度没有增加(2 g-k)。

2 CRISRP-FrCas9在水稻稳定植株中的高效基因组编辑

3.TREX2-FrCas9在不影响编辑效率的情况下实现多碱基删除编辑

FrCas9主要产生1bp的插入或者删除,这种小的InDel可以在蛋白质编码基因中产生敲除,但它们在编辑非编码基因(如微小RNA)或非编码区域(如顺式调节元件)方面不能发挥强大的作用。作者将三引物修复核酸外切酶2TREX2)与FrCas9N末端融合(3 a),将TREX2-FrCas9与野生型FrCas9在水稻原生质体中的18个内源靶位点进行比较。结果显示,TREX2-FrCas9不影响编辑效率(3 b),通过比较18个水稻内源位点的缺失谱,发现FrCas9主要产生1bp的删除,其次是2bp的删除(3 c)。相比之下,TREX2-FrCas9产生了6bp-10bp或更长的删除,并且删除大小在16bp-20bp处达到峰值(3 c)。此外,FrCas9在不同靶位点产生不同水平的插入和删除(3 d),但在TREX2-FrCas9编辑的靶位点中几乎没有任何可检测的插入(3 e)。

3 TREX2-FrCas9在不影响编辑效率的情况下生成更大的删除

4.TREX2-FrCas9介导的OsMIR156j有效删除编辑

为了进一步测试了TREX2-FrCas9系统的多碱基删除能力。作者在水稻T0代植株中应用TREX2-FrCas9实现了有效的OsMIR156j编码区域多碱基删除编辑(4 a-d),并在双等位基因删除的株系中进一步考察了OsMIR156j二级结构的变化(4 e),OsMIR156j-5p/3p表达量的改变(4 f),OsSPL家族部分基因的表达量的变化(4 g),明确了TREX2-FrCas9系统作为miRNA突变体创制工具的可行性。

4 TREX2-FrCas9介导的OsMIR156j有效删除编辑

5.基于FrCas9的胞嘧啶碱基编辑器及腺嘌呤碱基编辑器

基于对应于SpCas9切口酶(D10A)的FrCas9切口酶(D20A)、在哺乳动物中具有有效碱基编辑活性的FrCas9切口酶(E796A)、不同类型的胞嘧啶脱氨酶,作者在水稻中开发了不同版本的胞嘧啶碱基编辑器,实验结果表明FrCas9 CBE V2.1可以在水稻中实现高效的C-to-T碱基编辑(5)。

5 基于FrCas9的胞嘧啶碱基编辑器提供有效的C-to-T碱基编辑

基于FrCas9切口酶(E796A)及腺嘌呤脱氨酶,作者在水稻中开发了腺嘌呤碱基编辑器,实验结果表明FrCas9 ABE可以在水稻中实现有效的A-to-G碱基编辑(6)。

6 基于FrCas9的腺嘌呤碱基编辑器提供有效的A-to-G碱基编辑

6.FrCas9编辑器的全基因组脱靶分析

运用WGS全基因组评估水稻FrCas9TREX2-FrCas9系统的脱靶效应,选择18个水稻独立单株进行全基因组测序及分析7 a-b)。结果表明:与对照植物相比,FrCas9系统的InDelSNV数量没有显著差异7 c-d);TREX2-FrCas9系统的InDel数量没有显著差异,SNV数量显著增加且主要为C:G>T:AA:T>T:A7 c-f),所有SNV在基因组上随机分布7 g)。对所有植株的sgRNA依赖性脱靶位点进行检测,结果表明,这些sgRNA依赖性脱靶位点均没有发生突变7 h)。

7 FrCas9编辑器的全基因组脱靶分析

电子科技大学博士生何瑶西南大学博士生韩阳朔为论文共同第一作者。西部(重庆)科学城种质创制大学中心西南大学生命科学学院张勇教授、扬州大学张韬教授及马里兰大学Yiping Qi教授为论文共同通讯作者。该研究受STI 2030重大项目、国家自然科学基金面上项目等资助。

论文链接:https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.14363