碱基编辑系统在不引起DNA双链断裂的情况下能够对特定基因位点进行精确修饰，目前最主要的碱基编辑系统有两类：基于胞苷脱氨酶的胞嘧啶碱基编辑系统（CBE），实现C-to-T的转换；和基于腺苷脱氨酶的腺嘌呤碱基编辑系统（ABE），实现A-to-G的转换。已经报道的CBE系统包括：rAPOBEC1、hAID、PmCDA1、hAPOBEC3A和hAPOBEC3B等，在此基础上加入一个或多个尿嘧啶DNA糖基化酶抑制物（UGI）可以进一步提高C-to-T的编辑效率和产物纯度。但现有的碱基编辑器依然存在较多局限：一是编辑效率有待提升，尤其是在植物体系中；二是脱靶效应问题仍需优化，某些常用编辑器已检出明显脱靶编辑；三是同时编辑多种碱基的工具缺乏，难以满足更多样化的编辑需求。因此，开发高效、精准的新型碱基编辑器，对推动精准基因组编辑育种具有重要意义。

近日，Nature Communications在线发表了西南大学西部（重庆）科学城种质创制大科学中心张勇教授团队、马里兰大学Yiping Qi教授团队及扬州大学张韬教授团队题为“High performance TadA-8e derived cytosine and dual base editors with undetectable off-target effects in plants”的研究论文。该研究在水稻和番茄中对一系列TadA-8e来源的工程化胞嘧啶和双碱基编辑系统进行比较，筛选出具有高编辑活性和较窄编辑窗口的TadCBEa、TadCBEd和TadCBEd_V106W作为高效的CBE，以及一个单一脱氨酶结构域同时实现C-to-T和A-to-G的双碱基编辑系统TadDE。研究展示了TadCBEa和TadDE在水稻中进行多位点碱基编辑时具有高编辑活性和高编辑特异性，并列举了TadDE在作物功能获得性的工程化改造中的应用，进一步丰富了植物基因组编辑工具箱。

为了研究TadA-8e来源的CBEs（TadCBEs）是否能够在植物中有效地实现C-to-T，构建了一系列适用于植物系统的TadCBEs，包括TadCBEa、TadCBEd、TadCBEd_V106W、eTd-CBE和Td-CBEmax，以及双碱基编辑系统TadDE和TadDE-NG（图1a），在20个水稻内源位点处进行编辑活性的评价。结果表明，大多数TadCBEs和TadDE在水稻细胞中实现有效的C-to-T碱基编辑（图1b，c）。在20个目标位点中，TadDE在16个位点检测到C-to-T和A-to-G的同时编辑，且A-to-G碱基编辑效率与ABE8e相当（图1b，d）。所有这些碱基编辑系统的插入和缺失（indel）效率都非常低（图1b，e）。

图1. TadA-8e来源的碱基编辑系统在水稻细胞中的编辑活性评价

进一步评估了TadA-8e来源的CBEs和双碱基编辑系统在双子叶植物中的有效性，番茄原生质体转化结果表明，TadCBEs和TadDE在四个靶向位点处均有效实现了C-to-T编辑（图2a，b），TadDE显示出有效的A-to-G编辑（1.3%-10.0%）（图2c）。所有TadA-8e来源的碱基编辑系统的插入缺失频率都非常低（图2d）。与水稻原生质体中的数据一样，TadA-8e来源的CBE在番茄细胞中表现出比A3A_Y130F更窄的碱基编辑窗口（图2e），TadDE实现的C-to-T和A-to-G的碱基编辑窗口重叠（图2e），TadDE双碱基编辑系统在SlBlc-sgRNA01和SlBlc-sgRNA02位点的编辑事件表明TadDE在番茄细胞中实现了C-to-T和A-to-G的同时编辑（图2f）。

图2. TadCBEs和TadDE碱基编辑系统在番茄细胞中的编辑活性评价

随后，对TadCBEa和TadDE多位点编辑水稻材料进行全基因组测序以明确全基因组范围内脱靶编辑情况（图3a）。结果表明，TadCBEa和TadDE都未检测到基因组范围内的脱靶编辑（图3b-h）。对TadCBEa和TadDE在转录组水平上的脱靶效应进行了分析（图3a），与组织对照相比，TadCBEa和TadDE碱基编辑系统没有在水稻转录组中引入额外的C-to-U和A-to-I突变（图3i-m）。TadCBEa和TadDE在DNA和RNA水平上均未引发显著的脱靶编辑，表明它们在植物中是高度特异的基因组编辑工具。

图3. TadCBEa和TadDE碱基编辑系统在水稻植株中的编辑特异性分析

为了展示新型编辑系统的应用潜力，研究团队还应用TadDE双碱基编辑器编辑OsALS位点以对水稻的除草剂抗性进行工程化改造，获得了一个sgR17突变的除草剂抗性水稻单株（B1-01），以及五个sgR18突变的除草剂抗性水稻植株（B2-04至B2-08）（图4a-c）。B1-01单株携带了一个R190H突变（图4d），而B2-04至B2-08单株携带了G628E和G629S的单突或双突（图4e）。结构分析显示，这些突变都影响了OsALS酶的催化核心（图4f），阻止了草甘膦对水稻生长的抑制作用。TadDE在水稻中进行功能获得性的工程化改造，赋予了植株除草剂抗性。

图4. TadDE双碱基编辑系统在工程化改造水稻除草剂抗性中的应用

电子科技大学生命科学与技术学院2021级博士生范婷婷、2019级博士生刘诗诗，马里兰大学Yanhao Cheng博士，扬州大学博士生吴越超、西南大学西部（重庆）科学城种质创制大科学中心唐旭教授为论文共同第一作者。

论文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-49473-w