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种创中心张勇教授课题组开发基于Cas12 核酸酶祖先TnpB的紧凑型植物基因组编辑新系统
发布时间: 2024-09-03 17:07  作者:种创中心   来源:内部   浏览次数:

,西部(重庆)科学城种质创制大科学中心、西南大学张勇教授课题组及其合作团队Plant Communications在线发表了题为“IsDge10 is a hypercompact TnpB nuclease that confers efficient genome editing in rice”的研究论文。该研究工作在水稻中比较了多个被认为是Cas9、Cas12a核酸酶祖先的IscB家族、TnpB家族和Fanzor家族的核酸酶在植物中的基因组编辑活性,开发了基于TnpB家族成员IsDge10的单基因与多基因编辑工具,深入探讨了IsDge10系统在水稻中的编辑模式编辑特异性,提供了紧凑型IsDge10定向敲除植物基因组的编辑方案,丰富了植物基因组编辑工具箱。

近年来,CRISPR-Cas9、Cas12a核酸酶被广泛应用于动、植物及微生物基因功能解析、新种质创制工作中。然而,现有Cas9、Cas12a核酸酶尺寸较大 (>1200 aa),影响了基因组编辑系统的递送效率。因此,进一步挖掘小型化的核酸酶新成员,构建紧凑、高效、精准、应用范围广的基因组编辑新系统一直是研究者努力的重要方向。2023年,来源于IscB家族、TnpB家族和Fanzor家族的核酸酶陆续被报道,这些核酸酶具有空间结构紧凑、尺寸小的优势 (约400AA),显示了作为基因组编辑工具的潜在应用价值。然而,现有研究报道仅给出了IscB、TnpB和Fanzor在哺乳动物细胞中的明确编辑活性实验数据,而这些编辑工具能否在植物中进行基因组编辑仍有待研究 (Han et al., 2023; Saito et al., 2023; Xiang et al., 2023)

作者从来源于IscB、TnpB和Fanzor的6种不同的核酸酶中筛选得到了在水稻中编辑活性最好的IsDge10系统,通过水稻原生质体转化与扩增子通量测序对其编辑效率、编辑模式、编辑特异性等进行了分析。并基于此前开发的高效RZ核酸酶及双Pol II驱动CRISPR-Cas系统 (Tang et al., 2017; Tang et al., 2016; Zhang et al., 2021),成功开发了IsDge10多基因编辑系统,实现了基于IsDge10系统的水稻单基因编辑、多基因编辑。全文主要研究结果如下:

1、 为了探究TnpB、IscB和Fanzor能否在水稻中进行基因组编辑,作者选择了源于TnpB的IsDge10、IsDra2、IsYmu1、IsAam1,源于IscB的enIscB以及来源于Fanzor的SpuFz1(图1A),首先构建了通过II型启动子驱动核酸酶+III型启动子驱动相应guide RNA的表达(图1B)。基于水稻原生质体双荧光报告系统初筛,发现IsDge10、IsAam1、enIscB和SpuFz1在水稻细胞中显示了RNA引导的DNA特异编辑活性。进一步,作者基于水稻原生质体瞬时转化与扩增子通量测序策略,对IsDge10、IsAam1、enIscB和SpuFz1对水稻內源基因组DNA位点的编辑效率、编辑模式和编辑特异性进行了分析。结果表明:1)IsDge10编辑系统,在7水稻原生质体测试的位点中均能够进行编辑,其中活性最高达到15%,编辑能力显著优于其他三种编辑系统(图1C)2)针对IsDge10系统的编辑模式进行分析发现,IsDge10在水稻主要产生TAM远端13-23bp区间6-10bp的多碱基删除(图1D, 图1E);3)针对IsDge10系统的脱靶分析中,发现较on-target编辑活性相比,临近TAM 1-14bp处2bp的错配即可使IsDge10丧失编辑活性,15-20bp处2bp的错配降低IsDge10编辑活性(图1F),说明IsDge10核酸酶系统是一个高保真的、精准的基因编辑工具。同时,基于IsDge10编辑系统,在7个水稻稳定转化的测试的位点中均能够进行编辑,编辑效率最高达到25%(图1G),说明IsDge10能够在水稻中介导可遗传的编辑。

1. 基于IsDge10的植物单基因编辑系统构建、活性评价、编辑模式分析及特异性分析

2、 为了探究IsDge10在水稻基因组中的多基因编辑能力,作者开发了基于高效RZ核酸酶及双Pol II驱动的IsDge10系统(图2A),并通过水稻原生质体转化,与扩增子通量测序策略对IsDge10多基因编辑系统的编辑能力与编辑模式进行了分析。结果表明:1)IsDge10多基因编辑系统,在7水稻原生质体测试位点均能够进行编辑(图2B)2)针对IsDge10多基因编辑系统的编辑模式分析发现,主要产生TAM远端13-23bp区间6-10bp的多碱基删除(图2C, 图2D),这与单基因编辑系统的编辑模式一致。这些结果说明基于高效RZ核酸酶及双Pol II驱动的IsDge10多基因编辑系统能够在水稻中同时对多个位点进行编辑。

2. 基于IsDge10的植物多基因编辑系统构建、活性评价及编辑模式分析

值得说明的是,本文开发的TnpB家族成员IsDge10核酸酶植物编辑系统源于2023年中国科学院动物研究所王皓毅研究员团队从头挖掘的TnpB家族成员(Xiang et al., 2023),具备明显的知识产权原创属性,为我国开发独立自主的植物(动基因组编辑新系统提供了借鉴。

电子科技大学博士生张瑞为论文第一作者,西部(重庆)科学城种质创制大科学中心、西南大学生命科学学院张勇教授及马里兰大学Yiping Qi教授为论文共同通讯作者,研究工作得到了国家科技重大专项、国家自然科学基金等项目的资助。


论文链接:

https://www.cell.com/plant-communications/fulltext/S2590-3462(24)00422-X



References:


Han, D., Xiao, Q., Wang, Y., Zhang, H., Dong, X., Li, G., Kong, X., Wang, S., Song, J., Zhang, W., et al. (2023). Development of miniature base editors using engineered IscB nickase. Nat Methods 10.1038/s41592-023-01898-9.

Saito, M., Xu, P., Faure, G., Maguire, S., Kannan, S., Altae-Tran, H., Vo, S., Desimone, A., Macrae, R.K., and Zhang, F. (2023). Fanzor is a eukaryotic programmable RNA-guided endonuclease. Nature 10.1038/s41586-023-06356-2.

Tang, X., Zheng, X., Qi, Y., Zhang, D., Cheng, Y., Tang, A., Voytas, D.F., and Zhang, Y. (2016). A Single Transcript CRISPR-Cas9 System for Efficient Genome Editing in Plants. Mol Plant 9:1088-1091. 10.1016/j.molp.2016.05.001.

Tang, X., Lowder, L.G., Zhang, T., Malzahn, A.A., Zheng, X., Voytas, D.F., Zhong, Z., Chen, Y., Ren, Q., Li, Q., et al. (2017). A CRISPR-Cpf1 system for efficient genome editing and transcriptional repression in plants. Nat Plants 3:17018. 10.1038/nplants.2017.18.

Xiang, G., Li, Y., Sun, J., Huo, Y., Cao, S., Cao, Y., Guo, Y., Yang, L., Cai, Y., Zhang, Y.E., et al. (2023). Evolutionary mining and functional characterization of TnpB nucleases identify efficient miniature genome editors. Nat Biotechnol 10.1038/s41587-023-01857-x.

Zhang, Y., Ren, Q., Tang, X., Liu, S., Malzahn, A.A., Zhou, J., Wang, J., Yin, D., Pan, C., Yuan, M., et al. (2021). Expanding the scope of plant genome engineering with Cas12a orthologs and highly multiplexable editing systems. Nat Commun 12:1944. 10.1038/s41467-021-22330-w.